蛋白质长效化的研究

随着生物技术的飞速发展，蛋白质药物已成为生物技术新药的主要品种。如促红细胞生长素（EPO）、粒细胞集落刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、干扰素、白介素、胰岛素以及各种疫苗等。目前已有４０种以上重要的治疗药物上市，７２０多种生物技术药物正进行Ⅰ、Ⅲ期临床试验或接受ＦＤＡ审评，其中２００种以上的药物进人最后的批准阶段。但是蛋白质药物在体内会被快速清除，这是由于组织中大量存在的蛋白酶，能够水解蛋白质药物，使其丧失活性，同时由于肾小球的滤过作用，分子量小于６９ｋＤａ的分子在代谢过程中易被清除，肝脏在药物代谢过程中也具有重要作用， 因而蛋白质药物半衰期都很短。为了维持一定的疗效需要大剂量频繁用药，长期的反复注射不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应。因此临床上需要研制长效的蛋白质药物。目前，已经建立的改善蛋白质药物半衰期的技术包括：蛋白药物的化学修饰、蛋白质融合、微囊化／纳米粒、糖基化、构建抗蛋白酶突变体等。本文将上述五种技术用于蛋白质药物长效化的研究进展作一综述。

1、  化学修饰

化学修饰是延长蛋白质药物半衰期的一个有效途径。它是一种将分子量小的蛋白质药物共价连接到具有较大分子量的分子上，例如聚乙二醇和白蛋白，共价连接到大分子上能减小免疫原性，改善可溶性和生物学利用度，以及增加抗蛋白水解作用，同时也能够延长半衰期。然而，生物活性分子共价修饰的作用被内在生物活性的损失所限制，例如，由于空间位阻而使受体结合减少，无活性分子整合到活性肽的一个或多个位点而产生的异质性。终产物的结构异质性通常伴随着功能异质性，致使生物活性或酶活性减小。聚乙二醇是由环氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，ＰＥＧ类修饰剂和其他修饰剂相比，具有无毒性，良好的溶解性，免疫原性低，且相对分子量范围宽，选择余地大等优点。而且ＰＥＧ可以将它的许多优良特性赋予修饰后的生物分子。经聚乙二醇共价修饰后，蛋白质药物的相对分子质量有所增加，减少了药物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的稳定性，降低免疫原性，这些改变均有利于延长药物在体内的半衰期，从而，蛋白质药物的药代动力学和药效性质得到明显改善。例如，ＰＥＧ修饰的干扰素α（ＩＦＮ-α）与未修饰的ＩＦＮ-α相比，半衰期延长１０～２０倍；超氧化物歧化酶ＰＥＧ修饰前半衰期为５ｍｉｎ，ＰＥＧ修饰后半衰期延长至４．２ｈ。用ＰＥＧ５０００修饰胰高血糖素，然后检验此种修饰对胰高血糖素的构象和生物学稳定性的影响。检测胰高血糖素样品和 Ｐ Ｅ Ｇ修饰的胰高血糖素的二级结构，并评估其物理稳定性。发现未经修饰的胰高血糖素，分子间形成了许多β折叠结构，成纤维的延迟时间短；而ＰＥＧ修饰后的胰高血糖素只有少量的分子间β折叠，并未出现纤维，物理稳定性明显高于前者。

迄今为止，国外已有多种ＰＥＧ修饰的蛋白质类药物应用于临床。目前已经上市的ＰＥＧ化的蛋白药物有ＰＥＧ化的Ｌ-天冬酰胺酶（Ｅｎｚｏｎ公司的Ｏｎｃａｓｐａｒ）、

ＰＥＧ化的干扰素αｂ （ＩＦＮ-α、ｂ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ公司的ＰＥＧＩｎｔｒｏｎ）、ＰＥＧ化的干扰素αａ （ＩＦＮα-ａ）（Ｒｏｃｈｅ公司的Ｐｅｇａｓｙｓ）和ＰＥＧ化的粒细胞集落刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）（Ａｍｇｅｎ公司的Ｎｅｕｌａｓｔａ）。

2、  蛋白质融合

应用蛋白质融合能够构建具有双功能的目的蛋白，这种融合蛋白是将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达产物。在分子水平，这个技术具有设计简单灵活的特性，因为构建突变体时不需要插入连接序列而直接在Ｃ端或Ｎ端融合。因此，这种技术能广泛地应用于构建生物活性分子，而且它的应用性不会因为生物分子的大小或活性而受到限制。常选用半衰期较长，分子量较大的分子作为载体构建融合蛋白，人血清白蛋白（ＨＳＡ）或免疫球蛋白（ＩｇＧ）的Ｆｃ片段应用最为广泛。故以人血清白蛋白和Ｆｃ片段的融合技术为代表进行阐述。

人血清白蛋白是血浆中含量最多的蛋白，分子量６７ｋＤａ，它在血管和血管外室的循环中分布广，半衰期可达到１９天，且结构非常稳定，无明显的免疫原性，是血液中重要的物质输送和药物运输载体，所以它成为药物设计理想的载体蛋白， 用于改善药物的半衰期，延迟药物清除，增加药物暴露，减少注射频率，改善病人对治疗的顺从性和耐受性。目前，多种蛋白与ＨＳＡ融合后在实验动物体内半衰期的延长得到了证实，例如成功地将白蛋白与激素（胰岛素、天然胰高血糖素、人生长激素）、细胞因子（干扰素α-２ｂ、ＩＬ２） 等融合，获得更稳定的循环蛋白，融合蛋白同时具有人血清白蛋白的长半衰期， 和生物学活性及治疗特性。通过此技术已对许多蛋白质进行了改造。人胰岛素／白蛋白融合蛋白（Ａｌｂｕｌｉｎ）在小鼠体内半衰期比天然胰岛素提高了４２倍。在毕赤酵母中表达的胰高血糖样肽素-１融合蛋白（ＧＬＰ-１／ＨＳＡ）在小鼠体内的半衰期比单独的ＧＬＰ-１延长４倍。干扰素α融合蛋白（ＩＦＮ-α／ＨＳＡ）的半衰期比未融合的干扰素α（ＩＦＮ-α）延长了大约１８倍。利用抗体Ｆｃ段所特有的生物学功能与某些多肽蛋白融合也可增加该蛋白质的血浆半衰期。人ＩｇＧ免疫球蛋白是体内的主要抗体，它的半衰期约为２０天。ＩｇＧ融合蛋白的构建方式大多是将ＩｇＧ的Ｆｃ片段或ＣＨ片段的Ｎ端与活性蛋白的Ｃ端相连。Syntonix Pharmaceuticals公司开发的EPO-Fc为吸入制剂，目前正在对贫血患者进行临床I期试验 ，该制剂可延长半衰期和替代目前使用的注射剂，给药方便。该制剂的显著优点是无需反复注射 ，尤其是对未进行透析或正在接受腹膜透析的慢性肾病患者优点更显著。在试验中该制剂显示出良好的疗效。

3、  微囊化

微囊化技术已广泛用于增强治疗因子的药代动力学特性，改进药物稳定性以及使药物靶向释放等方面。用微囊包埋蛋白质和多肽药物，不仅可以通过缓释作用实现长效皮下注射制剂，而且可以通过微囊表面和粒径的设计，实现口服、黏膜给药、吸入等新剂型。此技术的原理是将药物活性部分包封于聚合层中，通过皮下或肌肉给药，聚合层随着时间减少，使药物从微囊中缓慢持续释放，这有利于稳定药物，减少胃肠道酶的破坏，改变其体内运转过程，延长药物在体内的作用时间。

现在蛋白质药物的微球注射制剂已经研究成功并应用于临床。它是用生物可降解聚合物作为骨架材料包裹蛋白质药物制成直径为１～２５０μｍ的可注射微球剂， 生物可降解聚合物主要包括淀粉、明胶、葡聚糖、白蛋白、聚乳酸（ＰＬＡ）、聚乳酸乙醇酸共聚物（ＰＬＧＡ）、聚邻酯、聚内酯和聚酐等。目前用于制备缓释微球的骨架材料主要是ＰＬＧＡ和ＰＬＡ，其中又以ＰＬＧＡ更为常用。

此外，美杜莎持续释放系统也被用于蛋白质药物缓释过程中，它是由多聚Ｌ-谷氨酸骨架组成，带有疏水的α生育酚分子，形成毫微球粒的胶体悬液。由于毫微球粒的疏水区域的药物相互作用产生了持续释放药物的效果。在体内，蛋白质药物被生理溶液中内源蛋白代替，导致药物缓释。蛋白质药物最高浓度显著降低，药物释放明显延长。美杜莎持续释放技术已经应用于静脉注射ＩＬ-２和ＩＦＮ-α（２ｂ），临床上已经应用于肾癌和丙型肝炎Ｃ的治疗。

目前聚乳酸及其共聚物类缓释制剂已经上市的药物有，促甲状腺激素释放激素ＴＲＨ类药物-曲普瑞林ＰＬＧＡ缓释微球，用于治疗前列腺癌，可缓慢释药１个月，是第一个多肽微球产品。亮丙瑞林ＰＬＧＡ缓释微球，主要用于前列腺癌及子宫内膜异位症，也可释药１个月。以后又有多种ＬＨＲＨ类似物的缓释微球注射剂先后上市。还有不少蛋白质药物的缓释微球注射剂正在实验室研究或动物试验阶段。

4、  抗蛋白酶突变体

生物药物的蛋白酶水解作用是给药技术发展中需要突破的重要障碍。因为蛋白质很容易被内源血清中或组织中蛋白酶分解，并且蛋白酶对蛋白的降解可以发生在吸收、分布及排泄等各个阶段，这就直接影响药物的体内半衰期、生物利用度、血浆清除率等参数。将一个或多个抗蛋白水解突变体引入到生物活性分子上，是药物设计和发展的研究焦点。体内的稳定作用也通过引入人造氨基酸类似物而达到。这些变体发生细小的构象变化，导致增强抗蛋白水解作用。例如，通过取代蛋白质一级结构中任意肽键，提高蛋白药物抵抗蛋白酶降解的稳定性，在模拟肽的生物活性的基础上，通过肽的骨架修饰，改变肽的主体结构，是拟肽设计的目标。为了提高核糖核酸酶Ａ（ＲＮａｓｅＡ）抵抗蛋白酶Ｋ和枯草杆菌蛋白酶水解的能力，通过定点突变，用Ｐｒｏ替代了Ａｌａ２０，经测定发现突变体酶（Ａｌａ２０ＰｒｏＲＮａｓｅＡ）的构象没有发生明显的变化，生物活性也和野生型ＲＮａｓｅＡ一样， 但是抵抗蛋白酶水解的能力显著增加。通过ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳结果显示，蛋白酶水解常数下降２倍。

5、  糖基化

蛋白质表面的糖链能够影响蛋白的药物动力学性质、生物活性和稳定性等，并且，糖基化是某些蛋白质发挥生物活性所必需的。对比治疗性蛋白质的糖基化形式和非糖基化形式，一方面蛋白质药物表面增加了侧链，提高蛋白质稳定性，阻碍蛋白酶对蛋白药物的降解作用，另一方面使蛋白质药物分子量增大，减少肾小球滤过。促红细胞生成素（ＥＰＯ）是一个高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白，它含有３个Ｎ糖链和１个Ｏ糖链。构建重组人促红细胞生成蛋白，分别在３３和８８位各增加一个Ｎ糖基化位点，研究结果发现重组人ＥＰＯ的体内半衰期是ＥＰＯ的３倍。重组人ＥＰＯ的Ｏ糖基化对于体内外活性及清除速率作用无关，而Ｎ糖基化不完全的重组人ＥＰＯ体外活性正常，体内活性则降低到体外活性的１／５００，且体内清除率也明显加快。因此，Ｎ糖基化对蛋白质药物的修饰有重要作用。重组人ＥＰＯ突变体（Ａｍｇｅｎ公司的Ａｒａｎｅｓｐ） 已经研制成功并上市。

组织纤维蛋白溶酶原激活剂（ｔＰＡ） 在体循环中的清除率很高，半衰期仅为６ｍｉｎ。Ｋｅｙｔ等构建了ｔＰＡ变体，发现突变体具有减少ｔＰＡ血浆清除率的特性，同时保持正常的纤维蛋白结合能力和血块溶解活性。有效延长半衰期的ｔＰＡ突变体是通过在Ｋｒｉｎｇｌｅ１处进行糖基化修饰，用Ａｓｎ替代Ｔｈｒ１０３形成，即ＴｔＰＡ。随后在２９６-２９９位置发生四等位基因替换反应〔ＫＮＲＲ（２９６-２９９ ）ＡＡＡ〕形成突变体（ＴＫｔＰＡ）。ＴＫｔＰＡ表现出抗纤溶酶原激活剂抑制因子１的能力比ｔＰＡ高８０倍。ＴＫｔＰＡ延长了体内清除时间，能够减小清除率，同时保持正常的凝血活性。因此可以作为有效的低剂量血栓溶解剂。

综上所述，目前已经发展了许多有效提高蛋白质药物半衰期的技术，各种蛋白质药物长效化方法都能够显著改善生物制品的稳定性，提高药物的生物利用度，延长在体内的半衰期。